ICG 标记多肽的核心是通过氨基（或巯基）偶联反应实现共价结合，关键在于控制反应条件和高效纯化。

一、实验核心准备

1. 试剂准备：纯度≥95% 的目标多肽（含游离氨基 / 巯基）、ICG-NHS 酯（或 ICG - 马来酰亚胺，匹配多肽反应基团）、无水 DMSO、无氨基缓冲液（如 PBS pH 7.2-7.4）、淬灭剂（如甘氨酸）。

2. 器材准备：避光离心管、磁力搅拌器、透析袋（MWCO 3.5-10 kDa）或 HPLC 系统、冷冻干燥机、紫外 - 可见分光光度计。

3. 多肽预处理：用无水 DMSO 溶解多肽，浓度调整为 1-10 mg/mL，确保无水分干扰反应。

二、标记反应步骤

1. 按多肽与 ICG 摩尔比 1:1.2-1:2 投料，将 ICG-NHS 酯用少量无水 DMSO 溶解后，缓慢滴入多肽溶液。

2. 室温下避光搅拌反应 2-4 小时，或 4℃过夜，全程避免光照和氧气接触。

3. 加入过量甘氨酸（终浓度 10 mM），继续搅拌 30 分钟，淬灭未反应的 ICG 活性基团。

三、产物纯化与收集

1. 透析法：将反应液转入透析袋，用 PBS 缓冲液 4℃避光透析 24-48 小时，每 6-8 小时更换一次缓冲液，去除游离 ICG。

2. 高效液相色谱（HPLC）法：采用反相 C18 柱，以乙腈 - 水（含 0.1%TFA）为流动相梯度洗脱，收集目标峰（通过 280 nm 和 780 nm 双波长检测确认）。

3. 冷冻干燥：将纯化后的溶液冷冻干燥，得到 ICG 标记多肽粉末，避光密封保存。

四、关键验证步骤

1. 纯度检测：HPLC 检测目标峰纯度≥90%，无明显游离 ICG 杂峰。

2. 标记率计算：通过紫外 - 可见分光光度计分别测定 280 nm（多肽）和 780 nm（ICG）吸光度，按公式计算标记率（理想值 0.8-1.2）。

3. 稳定性验证：将标记产物溶于 PBS，4℃避光放置 1 周，检测吸光度变化，确认无明显降解。